基因工程抗性基因筛选-基因工程抗性基因筛选原理
文章信息一览：
- 1、在基因工程中对受体细胞筛选过程中抗四环素基因被插入目的基因,之后...
- 2、基因工程里筛选问题
- 3、为什么筛选受体细胞时根据抗性基因而不是目的基因
- 4、基因工程原理:质粒的抗性基因有利于筛选重组DNA分子
- 5、抗性基因有哪些
- 6、植物基因工程的内容(基因克隆方法、连接、转化、筛选及鉴定)
在基因工程中对受体细胞筛选过程中抗四环素基因***入目的基因,之后...
这个教科书举的例子很不好，实际上根本就不用这个方法来筛选的。实际的方法叫做蓝白筛选。质粒上有一个抗生素抗药基因，保证只要转入质粒的细菌都能存活。在目的基因插入点的位置，是编码一个酶，叫做β-gal。这个酶可以降解底物形成蓝色物质。如果有目的基因插入，这个酶就不能表达。
利用基因表达载体上的标记基因筛选：例如：标记基因是四环素抗性基因，就用含有四环素的培养基培养活细胞，如果细胞活着，证明基因表达载体已经进入。不存活，表明没有进入受体细胞。
在基因工程以及分子生物学的范畴内，我们一般认为抗性基因就是为了筛选用的。当目的基因取代某一抗性基因的时候，科学家一定会考虑在该重组DNA上还会有另一抗性基因。假设目的基因导入了抗四环素基因，那么我们可以利用质粒上另一端的抗青霉素基因，首先，用青霉素筛选，然后培养成单菌落，用滤纸影印的方法。
青霉素可以抑制革兰氏阳性菌（多数细菌）细胞壁肽桥生成，从而抑制细菌繁殖；四环素可以抑制细菌蛋白质合成（似乎是抑制转录）抑制细菌繁殖。
标记基因和目的基因是连在一起的。用标记基因筛选基因载体的方法很简单，在表达载体上一般有两个甚至两个以上的标记基因，比如，一个是抗青霉素的基因，一个是抗四环素的基因，将目的基因插入到抗四环素的基因中，那这个表达载体就不能表达出抗。
基因工程里筛选问题
1、应该是用标记基因。因为标记基因可产生相应的性状（相应抗体），利用抗原－抗体杂交可表明目的基因是否已形成蛋白质产品进而筛选。DNA分子杂交技术是检验目的基因是否插入染色体DNA中（插入不一定表达）。
2、在实际的基因操作时，这种情况不应该发生。若是以抗性基因作为标记基因来做筛选，那么在载体选择时就会考虑这些。比如说你设计用某个抗生素基因作为标记基因，那么在选择载体时就应避免载体本身含有该基因。在这种外源基因本身携带抗性基因的情况下，重组子的选择一般就可以简单的用相应的抗生素直接筛选。
3、由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。
为什么筛选受体细胞时根据抗性基因而不是目的基因
1、举例：大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因（该基因可以认为是标记基因），当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
2、错误 通过含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定都含有目的基因（重组质粒），有可能是只含有质粒的受体细胞 。
3、***用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入...重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
基因工程原理:质粒的抗性基因有利于筛选重组DNA分子
1、如果受体细胞是细菌的话，可以挑选单克隆，进行菌液PCR。引物设计在抗性基因中，看pcr结果是否呈阳性，即能p出条带。最准确的，还是酶切鉴定。
2、如果在一个载体上有抗性基因，那么这个抗性基因就是标记基因，有助于筛选含重组DNA的细胞。
3、把目的基因连接到带有抗性基因的质粒上以后，就可以根据抗性来筛选带有该质粒的大肠杆菌，筛选出的大肠杆菌被认为是同时带有了目的基因，即该菌中成功导入了目的基因。
抗性基因有哪些
目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性 ，后者可产生对除草剂的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括 NPTII 基因（产生新霉素磷酸转移酶 ，抗卡那霉素） 、 HPT 基因（产生潮霉素磷酸转移酶 ，抗潮霉素）和Gent 基因（抗庆大霉素）等。
卡那霉素抗性基因，四环素抗性基因等。卡那霉素抗性基因：卡那霉素抗性基因常被用于构建质粒载体时，增加载体在细菌中的稳定性。并且可以赋予宿主细胞对卡那霉素的抗性，使得在筛选重组子时，可以通过添加卡那霉素来淘汰非重组子，从而更方便地筛选出含有重组DNA分子的克隆。
马铃薯Pto基因具有一个丝氨酸—羟丁氨酸激酶结构域，它表现对Pseudomonassyringae的抗性。水稻的Xa21基因蛋白包括一个LRR和一个激酶结构域。该基因控制对Xanthomonasoryzac的抗性。
抗性基因：所有能对逆境有所抗性（抵抗力）的基因都是抗性基因，比如抗高温的基因，抗高盐的基因，也包裹抗生素基因等。
植物基因工程的内容(基因克隆方法、连接、转化、筛选及鉴定)
目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。
载体构建：接下来，将目的基因通过特定的酶连接到质粒分子上，形成一个含有目的基因的新质粒分子。 转化：在这一步骤中，通常使用农杆菌作为载体将基因转移到植物细胞中。农杆菌能够侵染植物细胞，并促进细胞分裂，形成小疙瘩，即“冠瘿”。
在一个典型的转基因植物生产过程中，这些步骤分别称为目的基因克隆、载体构建、转化、重组，以及筛选。基因克隆必须得有这个需要被转的基因。现在最广泛使用的BT蛋白基因和抗草甘膦基因，就来自于两种细菌。因此，细菌来源的基因，也可以在植物中起作用。
基因工程的操作过程的主要步骤：切、接、转、增、筛（检）切：获得DNA片段，取得目的基因；载体的选择制备。
①转化 转化的方法是利用一定浓度的氯化钙溶液处理细菌，使带有目的基因的重组质粒进入到宿主细胞中的过程。②转导 转导是指借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上的方法。
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