磷酸化蛋白质组学研究思路-蛋白磷酸化研究方法
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简述检测蛋白质磷酸化的检测方法及其原理
磷酸化蛋白质的鉴定方法可以分为直接检测和间接检测两种。以下是几种常见的方法：免疫印迹（WB）：通过使用特异性抗体来检测靶蛋白质的磷酸化状态。在电泳分离蛋白质后，可以使用抗磷酸化特异性抗体识别磷酸化位点，并通过信号的强度来定量磷酸化水平。
目前研究蛋白质磷酸的方法有放射性同位素标记、生物质谱分析等多种方法。
磷 酸 化 蛋白在细胞中含量甚微。在质谱分析中，磷酸化肚段的信号往往被非磷酸化肤段的信号所抑制。因而磷酸化蛋白和肤段的富集在提高磷酸化 位点的检测中占有非常重要的地位。 1 磷酸化蛋白的富集 过 去 关 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要应用针对特 定蛋白的抗体进行免疫沉淀。
磷酸化检测可以用二级质谱啊，在正离子模式下，经过collision cell后中性丢失了98dalton（ser和thr）或216dalton（tyr）的肽段就可能是含一个磷酸化位点的磷酸化肽段。2 基本原理就是设计个bait将目的蛋白留在柱子上或沉淀下来。
做对比检测实验 例如 AKT蛋白磷酸化后P-AKT 做western blot检测，看看AKT和p-AKT表达量又没有相关性。或者做elisa实验，毛细管电泳或者HPLC也可检测相关性。
蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内容，在酶和其它重要功能分子活性的发挥、第二信使传递和酶的级联作用中起到重要的作用。蛋白质磷酸化是在一系列蛋白激酶的作用下完成的，本节主要介绍蛋白磷酸激酶的分离与分析和磷酸化蛋白质的分析方法。
蛋白质磷酸化的最重要的机制
1、蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
2、在细胞信号传导途径中，蛋白质磷酸化可以使蛋白质变为活性。
3、蛋白质的磷酸化作用是由蛋白激酶（PK）催化，使蛋白质发生磷酸化反应的过程，可对其底物蛋白质特定的氨基酸残基进行磷酸化修饰，从而引起相应的生理反应，以完成信号转导过程。
4、同时，也可以抑制某些转录因子与DNA结合，从而阻断基因的转录。这种磷酸化介导的基因表达调控机制可以使细胞对环境变化做出及时的反应，从而维持细胞内稳态的平衡。磷酸化还可以调节蛋白质的功能。蛋白质是细胞内最重要的功能分子，磷酸化可以改变蛋白质的结构和活性。
5、蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
6、有助于更好地理解癌细胞的生物学过程和治疗机理。同时，可以通过检测磷酸化水平来筛选新的治疗靶点。例如，某些疾病的治疗都是通过调节磷酸化水平来实现的。因此，对特定疾病相关的蛋白质磷酸化程度的深入了解，可以为疾病的治疗带来希望，为新药物的开发提供新的靶点。
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究策略主要包括如下：质谱法：通过测量蛋白质的质量来研究其特性，包括串联质谱技术（MS/MS）用于确定蛋白质的氨基酸序列和翻译后修饰等信息。
蛋白质组学的研究内容包括：蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Westemn等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
一 双向电泳。双向电泳（two-dimensional electrophoresis， 2-DE）与质谱（mass spectrum， MS）的结合是最常见的蛋白质组学的研究手段。
胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。
列举研究蛋白质磷酸化的主要实验方法并比较其优缺点。
质谱 首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。
质谱分析（MS）：质谱分析是一种直接鉴定磷酸化蛋白质和磷酸化位点的高效方法。它可以用于鉴定全体磷酸化蛋白质的组成，也可以用于鉴定特定磷酸化位点。a、磷酸化诱发消化：在质谱前进行蛋白酶消化，并使用质谱仪鉴定蛋白质酶解产物中的磷酸化位点。
1 磷酸化蛋白的富集 过 去 关 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要应用针对特 定蛋白的抗体进行免疫沉淀。但该法需要首先对 蛋 白有所了解，且不适合大规模研究。虽然，近来关 于针对磷酸化基团的抗体已经出现，但只有抗磷 酸化酪氨酸的抗体效果较好[41。
一）蛋白磷酸激酶的纯化蛋白激酶的纯化分微量纯化和大量纯化两种，前者通常应用在特殊条件下培养的细胞，后者一般应用于特殊的组织器官。微量纯化的优点是克隆化的细胞株具有均一的细胞类型并处于同步的细胞周期，细胞内成分可被放射性同位素特异标记，在细胞培养时加特殊因素可研究细胞内某些感兴趣的途径。
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