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细胞工程中的筛选-细胞工程两次筛选

细胞工程 8个月前 (05-09) 82

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1、HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。

2、在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。

（图片来源网络，侵删）

3、第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍***用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

4、只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。有限稀释与抗原特异性选择：由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需细筛选去除。

5、原理是把细胞放到HAT选择培养基中培养，未融合的细胞不能合成核酸，就会死亡。未融合细胞次黄嘌呤转移酶和胸腺苷酶活性正常，不能合成核酸。融合细胞可以通过旁路合成核酸，从而存活。

（图片来源网络，侵删）

6、年Littlefield首先发明了HAT（H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T——Thymidine 胸腺嘧啶核苷）培养基的选择培养。HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。

第一次筛选出已杂交的细胞第二次筛选出骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合的细胞所以要筛选两次。

原理是把细胞放到HAT选择培养基中培养，未融合的细胞不能合成核酸，就会死亡。未融合细胞次黄嘌呤转移酶和胸腺苷酶活性正常，不能合成核酸。融合细胞可以通过旁路合成核酸，从而存活。

第一次筛选的是杂交瘤细胞，因为假如A，B两种细胞融合，会有A，B，AA，BB，AB五种情况，筛选的是AB型细胞，第二次筛选能产生抗体的AB型细胞。用选择培养基筛选。

）单个骨髓瘤细胞（5 ）单个（效应）B淋巴细胞（二）筛选的目的———获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法用选择性培养基来完成，即HAT培养基。

第一步是筛选出可以产生抗体的浆细胞，第二步是选杂交瘤细胞，第三步是选能大量产生抗体的杂交瘤细胞。

第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍***用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

1、终次筛选的方法和目的：方法：通常***用流式细胞术（流式细胞仪）或细胞融合技术进行终次筛选。目的：终次筛选的目的是进一步筛选出具有更高亲和力和特异性的单克隆抗体。

2、由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。

3、所以最后体内体外培养前还有一步分离各种杂交瘤细胞，专一抗体阳性检测是为了保证我们现在所需要制备的这种单克隆抗体一直存在，避免实验操作失误导致产生的这种单克隆抗体的杂交瘤细胞死亡。

4、接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

1、可在HAT选择培养液中，在合成DNA主要途径被阻断的情况下，利用应急途径合成DNA，杂交瘤细胞仍能生长存活，因而被选择出来。

2、融合所用的瘤细胞是选择出来的HGPRT缺陷细胞株，因此不能在HAT培养基中生长，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖并分泌抗体。

3、因为淋巴细胞具有合成DNA的两条途径，因此杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及腺嘧啶核苷，通过不就合成途径合成DNA。

4、HAT选择培养基的作用是筛选出（杂交瘤细胞）。HAT选择培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。

5、HAT中筛选出的杂交瘤细胞是产生多种抗体的混合细胞，筛选是根据杂交瘤细胞既能无限传代又能在HAT培养基中生长的性质来进行的。

6、第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍***用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

关于细胞工程中的筛选，以及细胞工程两次筛选的相关信息分享结束，感谢你的耐心阅读，希望对你有所帮助。