考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度-考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度计算

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文章信息一览：

• 1、考马斯亮蓝法测可溶性蛋白的标准曲线的公式是什么
• 2、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度存在的误差?
• 3、影响考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的因素有哪些
• 4、(Bradford法)如何测定蛋白浓度?

考马斯亮蓝法测可溶性蛋白的标准曲线的公式是什么

标准曲线是根据测量结果自己算出来的，没有固定公式。考马斯亮蓝法 也称考马斯蓝染色法（coomassie blue staining）又称Bradford法，是 Bradford 于 1***6 年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

接着，吸取样品提取液0mL，放入具塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合后放置2分钟，在595nm下比色，记录吸光值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

ml）00.200.400.600.8000蒸馏水（ml）000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）020406080100在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

考马斯亮蓝染色法 此法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，用于微量蛋白质浓度的定量测定。其原理为：在一定浓度范围内，蛋白质与染料结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比。此法反应快速、操作简便、干扰物质少，适用于微克级蛋白质含量的测定。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度存在的误差?

1、确实，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度时，通常会通过已知浓度的蛋白质进行梯度稀释，然后测量OD595值。然而，这种方法并非没有误差，因为考马斯亮蓝与蛋白质的结合程度受到蛋白质分子上碱性集团数量的影响，这导致不同类型的蛋白质与考马斯亮蓝结合的能力存在差异。

2、考马斯亮蓝测定蛋白质浓度是较常用的方法，误差可尽量减到最小，需注意：测定OD值前，将分光光度计提前预热至少30分钟，可保证准确性；配制好的考马斯亮蓝溶液应放于4度保存备用；盐离子不会影响实验结果，但去污剂，如TRITONX-100，SDS等，会严重干扰实验结果。

3、原因如下：考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白质含量，仪器是752N型紫外可见分光光度计，***用牛血清白蛋白（sigma）做标准曲线，问题就出在标准曲线上，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是生物化学中的经典实验，是利用蛋白质和染料结合的原理。

影响考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的因素有哪些

1、一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

2、考马斯亮蓝法主要是用来测定蛋白质浓度的，它的干扰因素包括： 有一些物质会干扰考马斯亮蓝法，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

3、其吸光值与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质的定量测定。蛋白与考马斯亮蓝在2min左右达到平衡，反应非常迅速。粘结剂在室温下保持稳定1h。该方法制备的试剂简单，操作方便，反应灵敏度高。灵敏度比Lowry法高4倍，可测定微克水平的蛋白质含量。主要的不利因素是特殊蛋白的结构和缓冲液中的干扰剂。

4、Bradford法，也称考马斯亮蓝法，是通过蛋白质与考马斯亮蓝结合后产生的颜色变化来测定蛋白质含量。其基本原理是，亮蓝在电离状态下显示棕红色，与蛋白质结合后变为蓝色，吸收光峰在595nm处，吸光值与蛋白质含量成正比。

(Bradford法)如何测定蛋白浓度?

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。

***用Bradford法测定蛋白浓度，主要基于考马斯亮蓝染料与蛋白质结合的原理。这种结合具有特定的光谱特征，染料与蛋白质结合后的吸收值与蛋白质的浓度的对数呈现良好的线性关系。因此，可以通过测定染料的吸光度来推算蛋白质的浓度。

Bradford 法在1***6年由 Bradford 建立，其试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏度高，比 Lowry 法高4倍，可用于测定微克级的蛋白质含量。该方法适用于大多数蛋白质的定量，其测定范围为0～1 000μg/mL，最小可测5μg/mL的蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

确保吸光度在标准曲线范围内。通过样品液的吸光度在标准曲线上查找对应含量，得出蛋白质浓度。操作时，需注意在加入试剂后的5-20分钟内测定，以确保吸光度稳定；在混合时避免剧烈，防止产生气泡影响结果。以上步骤是Bradford法测定蛋白浓度的基本流程，但务必严格按照操作注意事项执行，以确保结果的准确性。

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