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edman蛋白质测序的缺点-edman法测定蛋白质一级结构方法的原理

蛋白质工程 2个月前 (03-13) 45

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文章信息一览：

另一种常用的C-末端分析方法是羧肽酶水解法。羧肽酶能够专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可分为羧肽酶A、B和C。使用羧肽酶测定末端时，需先进行酶的动力学实验，以选择合适的酶浓度和反应时间，确保释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

A. 肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，在100℃下反应，羧基末端的氨基酸会以游离氨基酸的形式释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。羧基末端氨基酸可通过抽提或离子交换层析分离分析。若羧基末端氨基酸侧链含有酰胺，如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不会产生游离的羧基末端氨基酸。

（图片来源网络，侵删）

首先，二硝基氟苯法（FDNB法）是一种用于测定蛋白质N端氨基酸的常用方法。其原理是将蛋白质的N端氨基酸残基与FDNB反应，生成一个稳定的共价加合物，通过分析该加合物的紫外吸收或质谱，可以确定N端氨基酸的种类。其次，二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）也是一种测定N端氨基酸的手段。

C-末端测定方法：- 肼解：通过将肽溶解在肼中，在100℃下进行反应，释放出C-末端的氨基酸。其余肽链部分与肼反应形成酰胺。对于带有侧链的羧基末端氨基酸（如酰胺、冬酰胺、谷氨酰胺），肼解不仅能产生游离的C-末端氨基酸，还能生成其他产物。

蛋白质多肽链C端测定方法：肼解法还原法羧肽酶法多肽合成通常从N端，即氨基端向C端，即羧基端进行。早期的多肽合成是在溶液中进行，称为液相合成法。液相合成法通过将单个N-α保护氨基酸逐个加到生长的氨基成分上，逐步进行合成。

（图片来源网络，侵删）

- 二甲基氨基萘磺酰氯法：Hartley等于1956年提出，使用丹磺酰氯与N端反应，生成磺酰胺衍生物，具有高灵敏性和稳定性，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。

多肽的氨基酸序列分析是鉴定多肽的氨基酸种类、数量和排列次序的过程，简称多肽测序，是多肽一级结构鉴定的关键内容。现今常用的多肽氨基酸序列分析方法有经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法和新型的质谱法。Edman降解法主要用于分析多肽的N末端序列，但对N末端封闭的肽链无能为力。

纯化蛋白质：用于序列分析的蛋白质应是分子大小均一，电游呈现一条带具有一定纯度的样品。 2分析蛋白质的氨基酸组成：用酸、碱等将蛋白质肽链水解为游离氨基酸，再用电泳、层析等方法分离、鉴定所有游离氨基酸的种类和含量，现在可用氨基酸自动分析仪来快速测定。

有两种方法，一是直接测序列法，常用Edman降解法，在弱碱性条件下多肽连N端氨基酸（阿尔发）与PITC反应，标记为苯氨基硫代甲酰蛋白质。肽链中的第一个肽键变弱，在无水酸的存在下发发生降解，第一个氨基酸（AA1）经过分子重排成为PTH-AA1结合层析技术即可确定氨基酸的性质。

1、质谱法：· 质谱法是一种强大的分析工具，用于确定氨基酸的质量或质量/电荷比（m/z），推断氨基酸序列。· 在蛋白质质谱法中，蛋白质或肽经酶切割成小片段后引入质谱仪分析。· 串联质谱（MS/MS）提供肽段详情，有助于精确确定氨基酸序列。

2、有两种方法，一是直接测序列法，常用Edman降解法，在弱碱性条件下多肽连N端氨基酸（阿尔发）与PITC反应，标记为苯氨基硫代甲酰蛋白质。肽链中的第一个肽键变弱，在无水酸的存在下发发生降解，第一个氨基酸（AA1）经过分子重排成为PTH-AA1结合层析技术即可确定氨基酸的性质。

3、最好方法是质谱分析。质谱分析是一种通过测量分子离子的质荷比（m/z）来确定化合物分子质量的技术。在质谱分析中，分析样品先被离子化，然后通过质谱仪器进行分离和检测，最终得到样品分子离子的质量和数量信息。肽和氨基酸都是蛋白质的组成部分，但它们之间存在一定的差异。

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