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蛋白质测定的原理-蛋白质测定的原理和操作步骤

蛋白质工程 2个月前 (03-06) 63

文章阐述了关于蛋白质测定的原理，以及蛋白质测定的原理和操作步骤的信息，欢迎批评指正。

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为了解决这一问题，科研人员不断探索新的测定方法，如氨基酸分析法、近红外光谱法等，这些方法能够更准确地区分蛋白质中的氮与其他氮源，从而提高蛋白质含量测定的准确性。尽管凯氏定氮法在蛋白质含量测定中存在一定的局限性，但它仍然是目前最常用的方法之一。

可以。凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。

（图片来源网络，侵删）

．5-2003食品中蛋白质含量测定）目的与要求学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。实验原理蛋白质是含氮的化合物。

蛋白质定量测定的方法凯氏定氮法凯氏定氮法是一种经典的蛋白质测定方法。该方法通过测定样品中氮的含量，进而推算出蛋白质的含量的。其原理是样品中的氮在催化剂的作用下，经高温分解，生成氨并与硫酸结合生成硫酸铵。通过滴定法测定生成的氨，从而计算出样品中的蛋白质含量。

实验目的：掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。学习使用凯氏定氮仪进行实验操作。了解样品中蛋白质含量的变化对营养价值的影响。实验原理：凯氏定氮法是一种测定样品中蛋白质含量的经典方法。

（图片来源网络，侵删）

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

双缩脲法（Biuret法）实验原理是双缩脲与Cu2+形成紫色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。干扰物质包括硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸。Folin-酚试剂法（Lowry法）通过Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色。

双缩脲法则是基于蛋白质中的肽键与Cu2+反应生成紫红色络合物的原理。在180℃下，尿素脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中可与Cu2+形成稳定的络合物。通过比色法测定蛋白质含量。其缺点在于灵敏度较低，样品必须可溶，且在糖类和脯氨酸存在下效果不佳。准确度较高，不受蛋白质种类影响。

凯氏定氮法凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1833年建立的，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析有机化合物含氮量的常用方法。

测定蛋白质含量方法有多种。凯氏定氮法凯氏定氮法是一种经典的蛋白质含量测定方法。该方法通过消化样品中的蛋白质，使其中的氮元素释放出来，然后通过化学方法测定氮含量，进而推算出蛋白质含量。这种方法适用于多种样品，包括食品、生物样品等。

实验原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

SDS）和0.1N的NaOH。紫外吸收法则利用蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的共轭双键吸收紫外光，吸光度与蛋白质含量成正比。此法简便、快速，但准确度较差，干扰物质多。以上方法各有优缺点，在选择测定方法时需考虑实验要求的灵敏度和精确度、蛋白质性质、溶液中干扰物质以及测定时间。

1、各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。该法测定范围为0．01～1．0 mg/ml。样品中核酸对紫外光的吸收会影响蛋白质浓度的测定结果，但核酸的吸收高峰在260nm附近。

2、紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

3、准备1毫升含有1毫克蛋白质的溶液。取一个1毫升的量杯，加入1毫升的待测蛋白质溶液。向量杯中加入3毫升的蒸馏水。轻轻摇匀，确保蛋白质溶液和蒸馏水充分混合。通过以上步骤，我们就得到了一个1毫克/毫升的蛋白质溶液，可用于紫外吸收法测定蛋白质含量。

4、在紫外分光光度法中，蛋白质中的肽键在280nm处有强烈的吸收。通过测定溶液在280nm处的吸光度，可以确定蛋白质的含量。此法的优点是灵敏度和准确度都很高，可以用于微量蛋白质的测定。考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法是一种基于染料结合法的蛋白质测定方法。

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